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Medical Park Bad Wiessee St. Hubertus
Vergleich zweier trägerfreier Kultursysteme bei der chondrogenen Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen
Zielsetzung der Arbeit: In den letzten Jahrzehnten ist eine steigende Morbiditätsrate bei degenerativen Gelenkerkrankungen zu verzeichnen, die hauptsächlich auf folgende Parameter zurückzuführen ist: längere Lebenszeit, ungesunde Ernährung, mangelnde Bewegung oder ausgeprägter Leistungssport. Da Knorpelgewebe nicht in der Lage ist, sich zu regenerieren, steigt die Anzahl an Hüft-Endoprothesen-Erstimplantationen (im Jahre 2007 auf 152.338 in Deutschland; BQS-Bundesauswertung 2007; Bundesgeschäftsstelle Qualitätssicherung GGMBH).
Durch eine Knorpeldegeneration wird die Lebensqualität der Betroffenen stark beeinträchtigt. Deshalb werden sowohl die Vorbeugung als auch die Behandlung von Gelenkerkrankungen intensiv erforscht. Zu diesem Zweck setzen sich Wissenschaftler einerseits mit der Entwicklung, dem Aufbau, der Biomechanik, der Physiologie und der Pathophysiologie des Gelenkknorpels, andererseits mit der Pathogenese von degenerativen Gelenkerkrankungen auseinander. Die gewonnenen Erkenntnisse werden in der regenerativen Medizin umgesetzt, um implantierbare knorpelähnliche Geweberegenerate in vitro herzustellen. Mit der Deckung eines Knorpeldefektes durch ein Geweberegenerat soll die funktionelle Oberfläche des Gelenkes ausgebessert werden. Aufgrund des chondrogenen Differenzierungspotentials von mesenchymalen (Stamm-zellen MSCs), versucht man, MSCs in vitro zu artikulären Chondrozyten zu differenzieren. Hierbei werden auch Erkenntnisse über die Chondrogenese in vivo verwendet.
Für die vorliegende Arbeit wurden humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) in dreidimensionalen, trägerfreien, hochdichten Zellkulturen kultiviert. Zwei Kultivierungstechniken, die Membran-Kultur und die Pellet-Kultur, wurden dabei verwendet und miteinander verglichen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, wie erfolgreich die chondrogene Differenzierung von hMSCs in Passage 7 erfolgt, wenn Zellen einerseits in flüssigem Nährmedium, andererseits an der Luft-Nährmedium-Grenze kultiviert werden. Zur Induktion der Chondrogenese wurde das Nährmedium mit den die Chondrogenese induzierenden Wachstumsfaktoren versetzt.
Zusammenfassung:
Aufgrund der Zunahme von Gelenkerkrankungen wie Arthrose besteht ein steigender Bedarf an rekonstruktiven Maßnahmen mit dem Versuch der Herstellung knorpelartigen Gewebes. Der hyaline Gelenkknorpel ist durch die spezifischen Knorpelzellen, aber auch durch den Aufbau von ECM charakterisiert, die die Stützfunktionen gewährleistet. Proteoglykne und Kollagen Typ II garantieren die Druck- und Zugfestigkeit der Matrix und werden von Chondrozyten synthetisiert.
Die Herausforderung besteht nicht nur in der Differenzierung von Chondrozyten, sondern ebenso in der Erschaffung einer funktionellen Matrix. Daneben wird versucht, eine optimale Steuerung der in-vitro-Differenzierung unter Umgehung der Hypertrophie und Aufrechterhaltung des Chondrogenen Phäntotyps zu erzielen.
Ziel dieser Arbeit ist es, eine Kulturform zu untersuchen, die auf hochdichten Zellkulturen basiert, in denen differenzierte Zellen eine autologe Matrix hervorbringen. Die Membran-Kulturen wurden mit herkömmlichen Pellet-Kulturen verglichen und unter dem Einfluss verschiedener Wachstumskulturen auf ihr chondrogenes Potential untersucht.
In der vorliegenden Arbeit wurde die in-vitro-Differenzierung von hMSCs in Passage 7 in Richtung der chondrogenen Linie in hochdichten 3D-Zellkulturen an der Luft-Medium-Interphase (Membran-Kultur) und im Medium (Pellet-Kultur) verglichen. Hierbei wurden unterschiedliche Wachstumsfaktoren verwendet. Die Kulturen wurden teilweise mit FGF vorstimuliert und dann mit den Wachstumsfaktoren FGF und TGFF-ß3 oder der Kombination über drei Wochen differenziert. Undifferenzierte Kulturen wurden als Kontrollen verwendet. Danach wurden die Kulturen auf ihr Genexpressionsmuster mittels Real-Time- PCR (Kollagen Typ II und Aggrekan, Kollagen Typ X und Kollagen Typ I) untersucht.
Die Kulturen wurden histologisch und immunhistologisch auf knorpelspezifische Marker (Aggrekan, Kollagen Typ II) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung der hMSCs in Passage 7 in Pellet-Kulturen ein höheres chondrogenes Differenzierungspotential aufwies, al die nur teilweise erfolgte Differenzierung in Membran-Kulturen. Dies ließ sich aus der nachgewiesenen Expression von Kollagen Typ II in Pellet-Kulturen sowohl quantitativ auf mRNA-Ebene (Real-Time PCR) als auch histologisch erschließen. Währenddessen exprimierten Membran-Kulturen kein Kollagen Typ II. Außerdem zeigten sie eine geringere Expression von Aggrekan.
Das führt zur Aufstellung der Hypothese, dass die Bedingungen im Medium (Pellet-Kultur) die Differenzierung von hMSCs in Passage 7 in Richtung der chondrogenen Linie besser unterstützen, als die Bedingungen der Membran-Kultur. Mögliche Ursachen für die Unterschiede bei der chondrogenen Differenzierung könnten aus dem Einfluss des Sauerstoffs an der Oberfläche der Kulturen resultieren.
Obwohl inmitten des Pellets auch sauerstoffarme Bedingungen herrschen, führt die Membran-Kultur nicht zum Abschluss der chondrogenen Differenzierung von MSCs. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch andere Faktoren, wie der hydrostatische Druck und die Diffusionskapazität der Wachstumsfaktoren, die Chondrogenese beeinflussen können.
Zusammenfassend kommt die Technik Membran-Kultur für die weiteren Versuche bei der chondrogenen Differenzierung von MSCs in Frage, falls sie bezüglich der chondrogenen Bedingungen modifiziert wird. Zum Beispiel, Herstellung von sauerstoffarmer Situation an der Oberfläche der Zellkultur und vom dynamischen hydrostatischen Druck könnte das chondrogene Potential der Technik Membran-Kultur erhöhen.
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Quelle:
Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München, 2011
Vorgelegt von Irina Tebenkova, Assistenzärztin
an der Klinik Medical Park Bad Wiessee St. Hubertus.
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